Chondrostereum purpureum. El «plaguicida» de las frondosas

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Chondrostereum purpureum. El «plaguicida» de las frondosas

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Descripción

Mycelio aislado de una cepa Palentína de Chondrostereum purpureum. Es un aislado de esta fructificacion del video:

Una seta que se utiliza para controlar plagas de arboles frondosas en bosques de coniferas (patógeno de planifolios). Aquí pongo un video sobre ello:

Existe una pantente sobre su uso en Canadá. Adjunto texto traducido y modificado de la patente (las tablas hay que buscarlas en el enlace original)

CONTROL BIOLÓGICO DE ÁRBOLES CADUCIFOLIOS CON CEPAS DE CHONDROSTEREUM PURPUREUM

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al control biológico de árboles caducifolios maleza. Más particularmente, la invención se refiere a nuevos cultivos purificados del hongo Chondrostereum purpureum, su uso en composiciones y métodos para controlar biológicamente árboles caducifolios maleza.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A menudo es necesario controlar la vegetación indeseable o los árboles caducifolios maleza para proporcionar un crecimiento óptimo de las plantaciones forestales o para asegurar el acceso para el mantenimiento de los equipos instalados o utilizados en áreas forestales.

Los métodos de control que se utilizan actualmente en el campo son principalmente el corte mecánico y la aplicación de herbicidas químicos. Sin embargo, la tala mecánica de árboles caducifolios estimula un fuerte rebrote de brotes, lo que genera la necesidad de una tala más frecuente y un aumento continuo de la densidad de tallos y el costo de mantenimiento. Además, las presiones ambientales y las regulaciones gubernamentales requieren claramente una reducción significativa en el uso de pesticidas químicos y, en algunos países, el uso de químicos ya está prohibido.

El control biológico de la vegetación es una alternativa eficaz a los métodos utilizados actualmente en el campo ya que promueve un patrón de retorno compatible de la cubierta vegetal para:

  • asegurar un mayor grado de productividad de las plantaciones forestales permitiendo el crecimiento de especies valiosas y limitando las indeseables especies de valor agregado en el mismo sitio;
  • asegurarse de que los equipos instalados en el bosque funcionen adecuadamente;
  • reducir el ciclo de retorno del corte mecánico que da el efecto inverso del objetivo inicial debido a la fuerte brotación y rebrote; – gestionar de forma óptima los costes de mantenimiento;
  • eliminar el uso de plaguicidas químicos tóxicos nocivos para el medio ambiente y la población.

El hongo de origen natural Chondrostereum purpureum (algunas veces denominado en lo sucesivo C. purpureum) es un agente conocido para el control biológico de árboles maleza de hoja caduca. El hongo juega un papel beneficioso en la descomposición de la madera y en los procesos de reciclaje. Cuando se aplica a tallos recién cortados, coloniza el tocón e inhibe la brotación y el rebrote. Debido a que el hongo se puede aplicar selectivamente, su uso para el control de los árboles objetivo o especies de árboles no amenaza el uso de árboles de la misma especie para fines comerciales o de otro tipo.

Debido a los problemas asociados con el uso de herbicidas químicos o cortes mecánicos, claramente se necesitan métodos más seguros y efectivos para controlar biológicamente las malas hierbas. Hasta la fecha, ningún aislado de C. purpureum utilizado como agente de control biológico ha tenido éxito comercial para el control biológico de malezas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos cultivos purificados del hongo Chondrostereum purpureum que se han depositado con los números de depósito 090502-01 y 090502-02 en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá (IDAC) el 9 de mayo de 2002. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de estas cepas de C. purpureum para el control biológico de árboles caducifolios maleza.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona una composición para controlar biológicamente árboles caducifolios maleza. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para inhibir la brotación y el nuevo crecimiento de árboles caducifolios maleza recién cortados. Las composiciones de la invención comprenden una cantidad eficaz de al menos un hongo como se define anteriormente y un vehículo ambientalmente aceptable.

La presente invención proporciona un método para controlar biológicamente árboles caducifolios maleza que comprende la etapa de colonizar los árboles con una cantidad eficaz de al menos un hongo como se define anteriormente o con una composición como se define anteriormente.

La presente invención proporciona un método para inhibir la brotación y el nuevo crecimiento de tallos recién cortados de árboles caducifolios maleza que comprende el paso de aplicar a un tocón una cantidad efectiva de al menos una cepa de hongo como se define anteriormente o con una composición como se define anteriormente para para obtener una colonización del muñón por el hongo. Sin embargo, de acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un método para controlar biológicamente árboles caducifolios con malas hierbas, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) cortar un tronco de un árbol para obtener un tocón;

b) aplicar sobre dicho muñón, una cantidad efectiva de al menos un hongo como se define anteriormente o una composición como se define anteriormente.

Una ventaja de la presente invención es que el uso de las cepas de C. purpureum como agente de control biológico no implica ninguno de los peligros comúnmente asociados con los herbicidas químicos convencionales. Además, se ha encontrado que es particularmente ventajoso usar C. purpureum IDAC 090502-01 y/o IDAC 090502-02 o debido a su efectividad para inhibir la brotación y el rebrote en tocones cortados de especies de árboles de hoja caduca en situaciones de manejo de vegetación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE EL INVENTO

La presente invención se refiere en general a dos nuevas cepas de Chondrostereum purpureum y su uso en composiciones y métodos para controlar biológicamente árboles caducifolios maleza, y más específicamente a su uso como agente biológico para inhibir la brotación y el rebrote en tocones cortados de especies de árboles caducifolios.

  1. Cepas de Chondrostereum purpureum. Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a dos (2) cultivos purificados del hongo Chondrostereum purpureum que han sido depositados en la Autoridad Internacional de Depósito de Canadá (IDAC) con los números de depósito 090502-01 y 090502 -02 el 9 de mayo de 2002.

1.1 Caracterización de los aislados de C. purpureum de la invención

1.1.1 Designación taxonómica de HQP y E64P 1.1.1.1 Clasificación: Reino: Hongos Clase: Basidiomicetos Orden: Aphyllophorales Familia: Corticiaceae Género: Chondrostereum Especie: Purpureum Cepa: HQ1 y E64 Patovar: NA

Las cepas HQP (IDAC 0905O2-01) y E64P (IDAC 090502-02) son cepas purificadas de aislados HQ1 y E64 (P para purificado, consulte la técnica a continuación).

1.2. Identificación de las cepas

Las cepas de la presente invención proceden de Chondrostereum purpureum. El hongo fue identificado por primera vez por observaciones visuales de micro y macrocaracterísticas y por su comparación con las descripciones publicadas por Chamuris, GP (1988. The non-stipitate steroid fungi in the noreste de Estados Unidos y Canadá adyacente Mycologia Memoir No. 14. Editado por J. Cramer, Stuttgart, Berlín) y Nakasone, KK (1990. Estudios culturales e identificación de Corticiaceae que habitan en la madera e Hymenomycetes seleccionados de América del Norte. Mycologia Memoir No. 15 (ed. J. Cramer), Stuttgart, Berlín. Cepas de la presente invención han sido identificados mediante pruebas de ADN (RAPD).

1.1.2.1. Caracteres macroscópicos:

  • Los basidiocarpos son flexibles con una textura coriácea cuando están frescos pero se vuelven quebradizos cuando se secan. • Los basidiocarpos son efuso-reflejos. • La superficie superior es lanuda y está cubierta de pelos cortos rizados (tomentosos) y están presentes las típicas bandas de color violeta oscuro. • La superficie del himenio es morada.

Todas estas características fueron suficientes para identificar al espécimen como perteneciente a la especie C. purpureum.

1.1.2.2 Caracteres microscópicos:

  • Las hifas tienen paredes delgadas con tabiques nudosos y están escasamente ramificadas. • Los cistidios están incrustados en el contexto subhimenial. • Los cistidios son esféricos, globosos a piriformes e hialinos. • Los cistidios tienen un solo tabique en su base y su capa de material resinoso se disuelve fácilmente en KOH al 2%. • Las basidiosporas son en su mayoría elipsoidales, incoloras, lisas y unamiloides (negativas al reactivo de Meltzer).

El cultivo de l hongo en agar de extracto de malta al 1,5% produjo micelio que creció muy rápido (10-15 mm/d) a 22-25°C, mostrando una apariencia lanosa a flocosa; dos características adicionales de C. purpureum. La identificación anterior, mediante observaciones visuales de caracteres micro y macroscópicos, se confirmó además mediante huellas dactilares de ADN usando análisis de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) (ver más abajo).

 

  1. Composiciones

Ventajosamente, los hongos de la invención se utilizan, individualmente o en conjunto, en una composición a5. Por lo tanto, según un aspecto, la presente invención se refiere a una composición para controlar biológicamente árboles caducifolios maleza. Más particularmente, la presente invención se refiere a una composición para inhibir la brotación de tocones recién cortados. Como se usa en el presente documento, el término «árboles caducifolios maleza» se refiere a la vegetación leñosa de hoja ancha, y más particularmente a los árboles que se consideran indeseables en la gestión forestal. Una lista no exhaustiva de árboles maleza incluye abedules, arces, cerezos, álamos, alisos, álamos, sauces y avellanos. Como se usa en el presente documento, el término «control biológico» se refiere a un proceso mediante el cual se retrasa o se inhibe la brotación y el nuevo crecimiento de un árbol caducifolio lleno de malas hierbas. Más específicamente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad efectiva de un hongo C. purpureum como se definió anteriormente, en asociación con un vehículo ambientalmente aceptable. Preferentemente, el hongo presente en la composición se encuentra en forma de micelio.

El vehículo presente en las composiciones de la presente invención es un vehículo ambientalmente aceptable. Dicho vehículo es ventajosamente no tóxico para el hongo y no dañino para la vegetación, los animales o los seres humanos que no son el objetivo. También puede ser biodegradable. Un experto en la materia sabrá cómo seleccionar vehículos adecuados, tales como vehículos que no sean perjudiciales para el medio ambiente. Según una realización preferida, el vehículo comprende un elemento nutritivo adecuado para sostener el crecimiento del hongo. El vehículo puede comprender además un agente inerte biodegradable para aumentar la adherencia del hongo al árbol. De nuevo, el experto en la materia sabrá seleccionar elementos nutritivos adecuados y/o agentes inertes biodegradables adecuados.

La composición de la invención se puede usar sola o como parte de una composición más compleja según el uso deseado. También puede ser parte de un paquete comercial con instrucciones para el uso del mismo. A este respecto, para la preparación de dichas composiciones y envases, se puede utilizar cualquier método bien conocido en la técnica.

La cantidad de un hongo presente en la composición de la presente invención es una cantidad efectiva. Una cantidad efectiva de un hongo de la presente invención es la cantidad necesaria para que el hongo promueva la descomposición parcial o completa de un árbol  para ser controlado biológicamente, y más particularmente, es la cantidad necesaria para retrasar o controlar completamente la brotación de árboles objetivo. La cantidad exacta de hongo a utilizar puede variar según los siguientes factores: el tipo de árbol maleza a controlar, la cepa de C. purpureum, las características del suelo y las condiciones ambientales y geográficas. Se entenderá que una CFU de una cepa de la presente invención superior a 1 x 107 CFU puede usarse junto con la presente invención. No obstante, y según una realización preferida, la cantidad de hongo que se utilice, en términos de micelio, varía de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x 107 CFU (unidad formadora de colonias) de C. purpureum por mililitro de la composición. A este respecto, se puede utilizar cualquier método bien conocido en la técnica para la producción de cultivo con tal concentración en CFU. Se pueden añadir otros agentes a la composición de la invención. Se pueden agregar agentes que pueden ser beneficiosos para el propio hongo. Por ejemplo, los agentes benéficos pueden ser aquellos que optimicen la eficiencia del hongo hacia el árbol maleza objetivo, aquellos que promuevan su crecimiento o su viabilidad, aquellos que promuevan su capacidad de adherencia al tocón y su capacidad de adaptación al medio ( condiciones secas, ONU, etc.) pueden usarse simultáneamente. Una lista no exhaustiva de agentes beneficiosos incluye vitaminas (como ácido nicotínico, biotina, tiamina, mioinositol, piridoxina).

De acuerdo con otro aspecto de la invención, el método para controlar biológicamente los árboles de malas hierbas comprende el paso de colonizar los árboles con una cantidad efectiva 5 de al menos un hongo o una composición de la presente invención. Además, la presente invención proporciona un método para inhibir la brotación y el rebrote de tallos recién cortados de árboles caducifolios maleza que comprende el paso de aplicar al tallo cortado una cantidad efectiva de al menos una cepa de hongo o con una composición como la definida anteriormente. Preferiblemente, en los métodos de la invención, la aplicación del hongo o la composición teo se realiza desde principios de primavera hasta principios de otoño y/o cuando las condiciones son propicias para el crecimiento y desarrollo de hongos. Más particularmente, el hongo o la composición se aplican sobre una superficie de corte transversal del árbol, generalmente cerca del suelo, como un tocón. Más específicamente, el hongo o la composición se aplican sobre un tallo recién cortado. Como se usa aquí, el término «tallo recién cortado» se refiere a un tallo cortado, tal como un tocón,5 que permite que un hongo de la presente invención inicie la descomposición de la madera y, más particularmente, que permita que dicho hongo controle la brotación y nuevo crecimiento de tal muñón. Lo más preferiblemente, un muñón fresco consiste en un muñón cortado aproximadamente 30 minutos o menos antes de la aplicación de la composición de la invención sobre dicho muñón cortado. y más particularmente que permitan que dicho hongo controle la brotación y el nuevo crecimiento de dicho tocón. Lo más preferiblemente, un muñón fresco consiste en un muñón cortado aproximadamente 30 minutos o menos antes de la aplicación de la composición de la invención sobre dicho muñón cortado. y más particularmente que permitan que dicho hongo controle la brotación y el nuevo crecimiento de dicho tocón. Lo más preferiblemente, un muñón fresco consiste en un muñón cortado aproximadamente 30 minutos o menos antes de la aplicación de la composición de la invención sobre dicho muñón cortado.

o La composición de la invención y/o una composición más compleja que la comprenda puede aplicarse de diversas formas. Por ejemplo, la composición se puede esparcir en una capa delgada sobre uno o más tocones del árbol maleza que se va a controlar biológicamente (en promedio 1 ml por tocón cortado). Alternativamente, la composición se puede rociar o se puede aplicar como un gel suave sobre uno o más muñones. Para preparar dichas composiciones,5 se pueden usar métodos bien conocidos en la técnica.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos ilustran la amplia gama de aplicaciones potenciales de la presente invención y no pretenden limitar su alcance. Se pueden realizar modificaciones y variaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica para probar la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos.

Ejemplo 1. Recolección y purificación de las cepas de la invención

Las cepas HQP y E64P se purificaron como se ejemplifica a continuación. Original

Se obtuvieron 5 cepas directamente del campo y se mantuvieron en la colección con el número de adquisición HQ1 y E64. Estos aislamientos fueron probados y seleccionados de varios cientos de candidatos sobre la base de su eficacia en diferentes especies leñosas de hoja ancha, sitios y tiempos de aplicación durante la temporada de crecimiento.

Durante los mismos experimentos también se probaron varios aislamientos adicionales recolectados y mantenidos en el banco de manera similar y los resultados confirmaron que HQ1 y E64 eran más eficientes. Varios de los aislamientos estrechamente relacionados se usaron para comparar la eficiencia de diferentes cepas de C. purpureum.

Como se usa aquí, el término «purificación» se refiere a un proceso aplicado al aislado fúngico para hacer posible una producción de micelio con una efectividad sustancialmente alta5 ([] preferiblemente superior a 107 CFU/mL). Los endófitos se mantienen preferiblemente en una concentración baja (102 CFU/mL). Esta ligera presencia de microorganismos (0,01%) no interacciona con el desarrollo fúngico, tasa de multiplicación y actividad en los árboles.

Los aislamientos se obtuvieron primero sembrando un fragmento de un esporóforo en agar de extracto de malta al 1,5 % que contenía benomilo (2,5 mg/l; 5 ml de una solución madre que contenía 2 mg de benomilo por ml de DMSO), sulfato de estreptomicina (100 μg/ml) y tetracicϊno (12.5 μg/mL), como se dijo anteriormente. Benomyl se esterilizó en autoclave con medio PCA, pero se añadieron clortetraciclina y sulfato de estreptomicina después del autoclave, en condiciones estériles. Este es el primer paso en el proceso de purificación. Se realizaron 5 réplicas en agar de extracto de malta al 1,5 % y después de 4-5 días de crecimiento en condiciones ambientales de laboratorio, los cultivos se almacenaron en un refrigerador a -4 °C. Se comprobó la presencia de contaminantes en diferentes medios (PCA, MA, PDA).

Después de este primer tratamiento con antibióticos, los aislados de la invención fueron tratados dos veces con antibióticos. Un tratamiento mecánico adicional conduce a una concentración de endófitos lo suficientemente baja como para permitir el cultivo. 1.1. Purificación de la tensión y control de la degeneración.

Para obtener la mejor efectividad del micelio, es preferible que se permita un nivel muy bajo de contaminantes (< 102 UFC/ml) y que no se permita la degeneración del hongo durante su multiplicación a alta concentración y su almacenamiento por largo tiempo en control.

1.1.1 Purificación por antibióticos

Tras varios ensayos fallidos de multiplicación de C. purpureum en los que la proliferación de bacterias y levaduras dentro de los medios de cultivo nutritivos limitaba el crecimiento del micelio, se han realizado dos pasos de purificación después del paso de purificación de la cepa original. El medio utilizado para la primera purificación (denominada MP2) fue agar extracto de malta al 1,5% con benomilo (10 mg/L), sulfato de estreptomicina (100 mg/L) y clortetraciclina (12,5 mg/L). Luego se logró un cultivo en medio estéril que contenía agar extracto de malta al 2% con DMSO (5 g/L), los cultivos primarios se mantuvieron en nitrógeno líquido.

Se eligieron benomyl, estreptomicina y clortetraciclina como antibióticos por las siguientes razones:

  • Benomyl es un fungicida muy conocido utilizado en agricultura, comercializado entre otros bajo el nombre de Benlate®, que se utilizaba para eliminar microorganismos hongos (levadura, Penicillium, Fusarium, etc.). Los hongos de orden superior no se ven afectados por el benomilo.
  • La clortetraciclina tiene un efecto bacteriostático conocido; no elimina la población de bacterias pero disminuye su tasa de crecimiento. Esto permite que los hongos crezcan en el medio de cultivo que contiene azúcar sin las bacterias. • La estreptomicina es un antibiótico de amplio espectro, que inhibe la síntesis de ciertas proteínas y tiene baja toxicidad para las plantas, lo que explica su amplio uso en cultivo de tejidos vegetales.

Los cultivos primarios se mantienen en nitrógeno líquido en lugar de 5 °C para limitar la proliferación de bacterias y otros microorganismos no deseados.

5 1.1.2 Purificación mecánica (replicación sucesiva)

Cuando se inicia un nuevo cultivo, se extrae del nitrógeno líquido un vial que contiene un fragmento del cultivo primario. El ciclo de cultivo se inicia en un medio de purificación MP2 durante un período de 3 días. Los extremos de las hifas se cortan y replican en medio PDA de agar de dextrosa de patata sin antibióticos. Este procedimiento representa la purificación mecánica y se puede realizar una segunda vez si es necesario.

1.1.3 Control de la degeneración 5 Existe un riesgo de degeneración para la cepa después de sucesivas purificaciones y la cepa podría perder su potencial de infectividad. Por lo tanto, es preferible realizar diferentes pruebas durante el inicio del cultivo para verificar el crecimiento de la cepa y su capacidad para formar colonias. Periódicamente, las características genéticas de la cepa de trabajo en cultivo se comparan con la cepa original con una prueba PCR-RAPD (reacción en cadena de la polimerasa – o ADN polimórfico amplificado al azar). No se ha visto ninguna degeneración después de muchos años (6).

1.2. Preservación y mantenimiento de la cultura.

Las cepas fúngicas HQP y E64P se han mantenido permanentemente en almacenamiento de nitrógeno líquido5 como el «Inóculo de semillas maestras». Periódicamente, los inóculos de la semilla de trabajo se replican a partir de la semilla maestra y también se almacenan en nitrógeno líquido. Se conservan un total de al menos 50 pastillas de micelio como inóculos de semillas de trabajo. Se realizan controles periódicos para garantizar que el patrón de ADN no se modifica durante la conservación.

Para preparar los aislados fúngicos para la conservación con nitrógeno líquido, se recogen muestras de micelio del borde de una colonia en crecimiento activo en medio de agar y se transfieren, 3 a la vez, a viales criogénicos estériles en los que se utiliza una solución de DMSO (dimetil- sulfóxido) se añade una solución estéril. Las ampollas se sellan y se sumergen inmediatamente en nitrógeno líquido. A partir de entonces, se transfieren a un gran contenedor permanente y la fecha, los números de referencia y la ubicación del vial se anotan en el libro mayor de nuestro banco de aislamientos de 5 hongos.

Ejemplo 2. Uso de las cepas de la invención para el control biológico de malezas

2.1. Ensayos de invernadero0 Se recuperó un total de 36 aislamientos de C. purpureum de varios lugares en las ecozonas canadienses 5, 4, 2 y 1, y de varias especies huésped (Cuadro 2).

Se evaluó la virulencia de doce aislamientos de C. purpureum en las nueve especies de árboles5. Estos incluían papel y abedul amarillo, roble rojo, cerezo negro, arce plateado y rojo, álamo temblón, álamo del este, álamo balsámico y manzana Mclntosh. Los tratamientos consistieron preferiblemente en cubrir las plántulas e inmediatamente aplicar micelio del hongo cultivado en medio Agar de extracto de malta (Difco) a la superficie lesionada expuesta. Los síntomas de infección por el hongo fueron monitoreados hasta por dos temporadas de crecimiento después de la aplicación.

La mortalidad de los árboles se utilizó como criterio para determinar la virulencia relativa entre los aislados de prueba. Este método permitió la clasificación de los aislamientos en grupos según la virulencia. También se evaluó la virulencia absoluta, respecto al control total (100% de mortalidad)5.

También se encontró una diferencia significativa en la virulencia entre los aislados. La cepa HQ1 fue la más virulenta en la comparación de virulencia relativa (Tabla 3), principalmente debido a la actividad en papel y abedul amarillo y en menor grado en roble rojo. Tabla 2; seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes en p=00,5 según estadístico G

2: Intensidad de los síntomas de la enfermedad en las plantas (V; muy afectada, MN moderadamente afectada, SV, levemente afectada) Se designó la cepa HQ1 para evaluación adicional y pruebas de campo. Sin embargo, en esos experimentos no se detectaron cepas muy o muy virulentas en términos de virulencia relativa, pero la concentración en el micelio fúngico fue baja.

  1. Pruebas de campo Se han realizado pruebas de campo para evaluar la eficacia de las cepas de C. purpureum de la invención para controlar el crecimiento de brotes en tocones cortados de varias especies de hoja ancha. Los primeros experimentos se diseñaron para evaluar tanto la susceptibilidad de cuatro especies objetivo (abedul de papel, álamo temblón, cerezo y arce de azúcar) como la eficiencia de dos cepas de C. purpureum que mostraron diferentes efectos en las plántulas durante las pruebas de invernadero, IB y E64. (Cuadro 4). Se llevaron a cabo ensayos de campo para evaluar el rendimiento de la cepa HQ1, que se seleccionó de pruebas de detección en invernadero, y compararla con E64 (Cuadro 5).

2.1 Métodos

5 Los tratamientos se aplicaron desde finales de la primavera, justo después de la plena expansión de las hojas, hasta principios del otoño, después de la senescencia de las hojas. En el momento del tratamiento, todos los tallos dentro de las parcelas se cortaron a una altura de 15 cm sobre el nivel del suelo usando una sierra de cepillo. El material vegetal cortado se eliminó del área de la parcela antes del tratamiento. Para parcelas grandes, las operaciones de corte se realizan por fajas de 0 de unos 2 m de ancho. El intervalo de tiempo entre el aclarado y la aplicación del hongo nunca superó los 30 min. La parte superior de los tocones recién cortados se cubrió con una fina capa de la composición de la invención: se aplicó una media de 0,5 – 2 ml, dependiendo del diámetro del tocón. 5 2.2 Análisis de infecciones

La evaluación de la colonización de tocones se realizó en submuestras de tocones tratados y no tratados para evaluar la capacidad de colonización de las cepas de prueba de C. purpureum y su persistencia en los tocones. Además, en algunos ensayos, se utilizó el análisis de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) para confirmar que las infecciones eran el resultado de los genotipos fúngicos aplicados.

2.3 Evaluación de la efectividad 5 Anualmente antes de la senescencia de la hoja, hasta 3 años después del tratamiento, para cada unidad de muestreo y para cada especie, se realizó un registro del número (Cuadro 4) o número y altura (fábrica 5) de brotes vivos en cada tocón . Para los experimentos a escala piloto se registraron tallos de todos los orígenes. Todos los brotes y tallos débiles que mostraron síntomas de plateado o marchitamiento se analizaron como tallos vivos. C. purpureum (testigo), o mezclado con cultivo de micelio de cepas E64 o IB C. purpureum) realizado en junio o agosto del mismo año.

*: diferente de la frecuencia media de brotación de los testigos ( adj = 0.O1 ). Sesenta árboles fueron utilizados en cada tratamiento. Las pruebas A y B son repeticiones distintas del experimento.

La adición de micelio de C. purpureum redujo significativamente la frecuencia de brotación en todas las especies. La cepa E64 tuvo un efecto más fuerte en todas las especies, pero más específicamente en el arce de azúcar, el álamo temblón (tratamiento de junio) y el cerezo (tratamiento de agosto). Tabla 5: Efectos de las cepas E64.y HQ1 sobre la brotación un año después del tratamiento

El micelio de C. purpureum se mezcló con arcilla y aceite en este experimento. El tratamiento de control consistió en cubrir los tocones con una mezcla de arcilla, aceite y agua.

La cepa HQ1 tuvo un mayor efecto que la cepa E64 en la reducción del tamaño de los brotes en cerezos y álamos, el número de brotes y la frecuencia de los brotes en abedul, específicamente.

Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención se han descrito en detalle en el presente documento y se han ilustrado en los dibujos adjuntos, debe entenderse que la invención no se limita a estas realizaciones precisas y que se pueden efectuar varios cambios y modificaciones sin apartarse del alcance. o espíritu de la presente invención.

Información adicional

Peso 0,04 g
Tipo

Grano 20g, Micelio en placa, Micelio en microtubo

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